qPCR 荧光定量 PCR 实验设计、引物验证、内参选择和数据分析要点

qPCR 分为染料法（SYBR Green）和探针法，基础课题绝大多数使用 SYBR Green 染料法，操作成本低、使用便捷；前提是引物特异性好，熔解曲线单一无杂峰。

一、上游 RNA 质控

Trizol 法提取细胞 / 组织总 RNA，Nanodrop 测纯度，琼脂糖电泳或者毛细管电泳看 RNA 完整性；RNA 降解会直接导致 qPCR 结果失真，组织样本取材后尽快液氮速冻，避免室温放置。 合格 RNA：A260/A280 在 1.8–2.1 区间。之后反转录得到 cDNA，cDNA 可分装 - 20℃保存，避免反复冻融。

二、引物设计与验证

引物是 qPCR 成败核心：引物跨内含子设计，避免基因组 DNA 干扰；正式实验前必须做引物验证，看扩增效率（90–110% 为佳）、熔解曲线是否单峰；出现双峰就是引物非特异扩增或者二聚体，需要重新设计引物。

三、内参基因选择（高频踩坑点）

不要固定只用 GAPDH、β-actin！造模、药物处理会改变部分内参稳定性；条件允许建议筛选 2–3 个稳定内参取几何平均。 例如纤维化、炎症模型，GAPDH 表达容易波动，优先评估 HPRT1、TBP 等。

四、上机体系设置

2×SYBR Green qPCR Mix（含 ROX）、上下游引物、cDNA 模板、无酶水配体系；设置无模板阴性对照 NTC，监控试剂污染；反应程序：预变性→循环扩增→熔解曲线采集。 每样本每个基因设置 3 个技术复孔，减少加样误差。

五、数据分析：2^-ΔΔCt 法

ΔCt = 目的基因 Ct−内参 Ct；ΔΔCt = 处理组 ΔCt−对照组 ΔCt；相对表达量 = 2^-ΔΔCt。 该方法前提：目的基因和内参扩增效率接近；效率差异大的时候，改用标准曲线法。

六、研录生物 qPCR 服务

研录生物可接收组织、细胞样本，完成 RNA 提取、反转录、SYBR Green qPCR 上机、熔解曲线分析，输出 Ct 原始数据、统计图表；配套 Trizol 试剂、SYBR Green qPCR Master Mix 试剂盒，支持批量样本、多基因检测外包，和 WB、动物建模配套一站式课题服务。