CCK-8 细胞活力检测方法与关键影响因素

CCK-8 试剂里面含有 WST-8，在活细胞脱氢酶作用下生成橙黄色水溶性甲瓒产物，颜色深浅和活细胞数量正相关，酶标仪 450nm 读取 OD 值，用来计算细胞存活率、抑制率，计算药物 IC50。

一、标准实验流程

1. 细胞悬液制备，计数，96 孔板铺板；根据细胞增殖快慢，提前铺板贴壁（24h）；

2. 加入梯度浓度药物或者刺激物，设置对照组、空白孔（只有培养基无细胞）；

3. 药物孵育结束，每孔加入 CCK-8 工作液，注意不要产生气泡；

4. 培养箱避光孵育，常规 1–4h，需要预实验确定最佳孵育时长；

5. 酶标仪 450nm 测吸光度，参考波长 600–650nm 扣除背景；

6. 计算公式：细胞存活率 =（给药组 OD - 空白 OD）/(对照组 OD - 空白 OD) ×100%

二、核心问题排查

1. 边缘效应：96 孔板外圈孔蒸发快，渗透压变化，细胞生长偏慢；方案：外圈孔加 PBS 不做实验，使用内圈孔；

2. OD 值整体偏低：细胞数量太少、药物强毒性、孵育时间不足、CCK8 失效；

3. OD 值很高、没有抑制梯度：药物没有活性、铺板密度过大、孵育太久信号饱和；

4. 复孔之间差异很大：吹打不均匀、加样误差、孔内气泡；加样使用排枪，轻柔加液。

三、CCK8 vs MTT 对比

• CCK8：水溶性，不用 DMSO 溶解，重复性更好，适合高通量筛选；缺点：试剂成本高于 MTT；

• MTT：甲瓒不溶于水，需要有机溶剂溶解，容易带来操作误差，毒性相对更大。

四、实验小技巧

• 不要在孔壁上加 CCK8，贴着孔底缓慢加入；

• 气泡会造成读数异常，有气泡用针挑破；

• 如果培养基含有酚红，会轻微干扰读数，统一空白扣除；

• 做 IC50 曲线，药物浓度梯度设置 7–9 个梯度，至少 3 次独立重复。

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