Western Blot 实验全流程：样本制备、转膜、孵育、条带杂带去除技巧

WB（蛋白免疫印迹）是分子、细胞、动物课题标配实验，用来验证造模、药物处理后蛋白表达变化，和 qPCR 转录水平结果互相佐证。整套流程分为蛋白提取、蛋白定量、SDS-PAGE 电泳、转膜、封闭、一抗二抗孵育、ECL 发光成像。

一、样本制备关键

细胞 / 组织样本提取蛋白，建议加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂（做磷酸化蛋白必加）；组织尽量低温研磨，避免蛋白降解；BCA 法蛋白定量，保证上样量一致，是条带对比可信的基础。 蛋白变性：上样缓冲液混匀，95℃煮沸 5–10min，分装冻存，避免反复冻融降解。

二、电泳、转膜要点

根据目标蛋白分子量配置分离胶；小分子蛋白用高浓度胶、大分子蛋白低浓度胶；转膜分湿转、半干转，湿转稳定性更好，适合新手；转膜缓冲液预冷，控制电流电压和时间，防止转膜不足或者转穿。 膜选择：NC 膜、PVDF 膜；PVDF 膜需要甲醇活化，结合能力更强，目前使用更多。

三、封闭与抗体孵育

5% 脱脂奶或者 BSA 封闭 1–2h；磷酸化蛋白检测不建议脱脂奶封闭，牛奶里含磷酸蛋白，容易造成背景升高，优先 BSA。 一抗推荐 4℃摇床过夜，结合特异性更好；二抗室温 1h，孵育后充分 TBST 洗涤，洗涤不充分是高背景头号原因。

四、发光与常见问题排查

使用超敏 ECL 发光试剂盒，滴加发光液后成像。

• 无条带：蛋白降解、一抗不匹配、转膜失败、上样量太低；

• 多条杂带：蛋白降解、抗体非特异结合、蛋白过度上样；

• 背景发黑：封闭不足、洗涤次数太少、二抗浓度过高；

• 条带拖尾：样本降解、胶配制不均。

五、研录生物 WB 服务

研录生物提供 WB 全包实验：组织 / 细胞样本接收、蛋白提取、BCA 定量、电泳转膜、抗体孵育、ECL 发光拍照，可根据客户方案选择内参、Marker，配套超敏 ECL 发光试剂盒、BCA 定量试剂盒，同时承接 IP、ChIP、免疫荧光等蛋白互作实验。