CCK-8 实验详细操作、分组设计与数据统计避坑指南

CCK-8 原理：试剂里 WST-8 在活细胞脱氢酶作用下生成橙黄色甲瓒产物，产物数量和活细胞数量正相关，酶标仪 450nm 读取 OD 值，间接反映细胞活力。对比 MTT，CCK-8 不需要溶解结晶，对细胞损伤更小，适合长时间给药梯度筛选。

一、前期实验设计（审稿非常看重）

1. 细胞预实验：确定合适接种密度，保证给药结束时细胞汇合度 70% 左右，避免长满接触抑制；

2. 分组设置：空白组（只有培养基 + CCK8，无细胞）、对照组（细胞 + 溶剂）、不同药物浓度梯度组，每组至少 3–5 个复孔；

3. 溶剂对照：药物用 DMSO 溶解时，DMSO 终浓度控制在 0.1% 以内，最高不超过 0.5%，高浓度 DMSO 本身会抑制细胞。

二、标准操作步骤

1. 细胞消化计数，96 孔板铺板，孵箱贴壁过夜；

2. 吸弃旧培养基，加入含不同浓度药物的培养基，按照预设时间梯度孵育（24h/48h/72h）；

3. 每孔加入 10μL CCK-8 试剂（注意不要产生气泡，气泡会干扰 OD）；

4. 避光孵育 1–4h，根据细胞类型调整孵育时长；

5. 酶标仪 450nm 测吸光度，参考波长 600–650nm 扣除背景。

三、高频问题与解决方案

1. 96 孔板边缘效应：外周孔水分蒸发快、渗透压变化，OD 偏低；方案：边缘孔不加细胞，填充无菌 PBS，只用中间孔做实验；

2. 复孔差异巨大：加样不均匀、细胞吹打不充分；细胞悬液全程反复吹打混匀；

3. 孵育时间过长：颜色过深，超出酶标仪检测线性范围，数据饱和，无法区分活力差异；

4. 气泡：读数前轻轻震板，肉眼清除孔内气泡。

四、数据计算

细胞活力（%）=(给药组 OD - 空白 OD)/(对照组 OD - 空白 OD)×100%，用 GraphPad Prism 拟合曲线，计算 IC50。

五、研录生物配套

研录生物可承接 CCK-8 细胞活力、毒性检测外包，支持梯度给药、多个时间点检测，配套 CCK8 检测试剂盒，同步提供 EdU 增殖、Transwell 迁移侵袭、流式凋亡等全套细胞功能学实验服务。