原代软骨细胞分离培养、成软骨诱导及阿利新蓝染色实操

软骨细胞属于终末分化细胞，体外极易发生去分化，失去 Ⅱ 型胶原表达，是软骨相关实验最大难点。很多课题使用大鼠、兔关节原代软骨细胞，配合成软骨诱导体系，用于软骨损伤修复、药物促软骨再生筛选。

一、取材与分离

取新生或者幼年 SD 大鼠膝关节透明软骨，在无菌冰 PBS 环境下剥离软骨，尽量剔除骨组织、滑膜；软骨剪碎成 1mm³ 细小组织块，先后用胰蛋白酶、Ⅱ 型胶原酶分次消化，过滤、离心收集细胞，接种于软骨专用培养基。

关键点：软骨取材全程低温，减少细胞凋亡；胶原酶消化时间需要摸索，消化过久细胞活性下降，消化不足细胞得率低。

二、原代软骨细胞培养与传代

原代 P0 代软骨细胞形态偏多边形、铺路石样；随着传代（P2、P3 之后）慢慢拉长，向成纤维样转变，也就是软骨细胞去分化。一般建议实验使用 P0-P2 代细胞，P3 之后 Ⅱ 型胶原表达明显下降，不适合诱导分化实验。 培养环境：37℃、5% CO₂，定期换液，及时清除漂浮死细胞。

三、成软骨诱导分化方案

使用商品化成软骨诱导培养基，连续诱导 14–21 天，每隔 2–3 天换诱导液；诱导结束后采用阿利新蓝染色（阿利新蓝 - 核固红染色），酸性黏多糖（糖胺聚糖）呈蓝染，直观判断软骨基质分泌情况。 同步鉴定：免疫荧光、qPCR 检测 Col2a1、Aggrecan 软骨标志物。

四、阿利新蓝染色常见坑

1. 固定不充分：基质脱落，染色偏弱；推荐 4% 多聚甲醛固定 15–30min；

2. pH 值不对：阿利新蓝染色液 pH 很关键，偏离标准区间染色背景脏、假阳性；

3. 分化时间不足：诱导 7 天基质很少，蓝染不明显，建议至少 14 天起。

五、研录生物服务

研录生物可定制分离大鼠、小鼠、兔源原代软骨细胞，同时提供干细胞成脂、成骨、成软骨三分化诱导服务，配套阿利新蓝、茜素红、油红 O 染色试剂盒，可直接承接染色拍照、图像分析外包，输出原始图片和定量结果。