Transwell 细胞迁移与侵袭实验操作规范

Transwell 小室分为上室和下室，中间带微孔滤膜。下室加入含血清 / 趋化因子培养基，形成浓度梯度，吸引上室无血清重悬的细胞向下穿过膜。

• 迁移实验：膜上不铺基质胶，只穿过微孔；

• 侵袭实验：膜表面提前凝固基质胶，细胞需要分泌基质金属蛋白酶降解基质胶才能穿过，模拟细胞侵袭基底膜。

一、侵袭实验基质胶铺胶要点（最容易翻车环节）

基质胶 4℃融化，全程冰上操作，稀释后均匀铺在上室膜内侧，37℃孵育凝固；基质胶浓度不能太高（太硬细胞穿不过）、不能太低（屏障失效）。迁移实验跳过铺胶步骤。

二、标准操作步骤

1. 细胞血清饥饿处理（减少血清本身带来的本底迁移）；

2. 细胞用无血清培养基重悬，计数，加到 Transwell 上室；

3. 下室加入含趋化因子 / 血清的完全培养基；

4. 培养箱孵育（迁移一般 12–24h；侵袭 24–48h，根据细胞类型调整）；

5. 取出小室，棉签轻轻擦掉上室内侧没有穿过去的细胞；

6. 多聚甲醛固定，结晶紫染色；

7. 显微镜拍照，随机视野计数穿膜细胞数量，统计迁移 / 侵袭率。

三、常见问题

1. 几乎没有细胞穿膜：孵育时间短、基质胶太厚、细胞活性差、趋化梯度不足；

2. 细胞全部堆在膜边缘：表面张力，加液避免气泡，减少边缘效应；

3. 组内视野差异巨大：棉签擦拭力度不一致，拍照统一选取中间视野；

4. 结晶紫背景脏：染色后漂洗不充分。

四、实验对照设置

空白对照、阴性对照、药物处理组；建议至少 5 个随机视野计数，设置 3 个复孔小室，减少误差。

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