兔骨髓间充质干细胞

兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离培养

【材料】

超净台、PBS、废液桶、75%酒精、手术包、percoll分离液、培养基、培养瓶等；

【方法】

1）兔处死后, 放入75% 的酒精内浸泡15 min，无菌条件下取出双侧股骨、胫骨、肱骨，去除附带组织,浸入生理盐水中清洗2次；

2）镊子和剪刀分离出股骨和胫骨，剔除骨头表面肌肉，PBS溶液冲洗两遍，酒精棉布擦拭，清理干净外骨骼，移入6cm培养皿；

3）培养液浸泡，剪掉头尾，露出骨髓腔用无菌注射器抽取含10%FBS的L-DMEM针头刺穿冲洗骨髓腔；

4）用培养液进行反复吹打，制备骨髓单细胞悬液转入离心管，1000 r/min离心3min，弃上清、脂肪层，重复离心1次；

5）细胞沉淀加入4ml含10%FBS的L-DMEM重悬细胞，使用Percoll梯度分离；

注：Percoll调整为1.073浓度，4ml细胞悬液加入含5ml分离液的离心管；

6）2000RPM/20min，取中间浑浊单核细胞层，PBS两倍稀释后悬液1000RPM/3min，弃上清，10%FBS的L-DMEM重悬细胞，移入10cm Dish，37°、5%CO₂培养；

7）24h后换液（视细胞贴壁情况），之后3天换一次液；

【培养】

干细胞**培养液 

【鉴定】

流式细胞鉴定：

阳性：CD29、CD90、CD44、CD105、CD166;

阴性：CD34、CD45、CD80、CD86;