三项分化

三项分化

间充质干细胞属于成体干细胞，在体外不同条件下诱导分化为骨、软骨及其他结缔组织，因其来源广泛，分离无创伤，较低的免疫原性、生长周期短等特点，是组织工程种子细胞的重要来源。干细胞的诱导分化一方面是干细胞鉴定的主要方法，另一方面也是干细胞功能学研究的主要途径。采用体外条件培养基诱导培养下，人间充质干细胞应能够分化为成脂肪骨、软骨细胞。成脂分化经油红O染色法鉴定，成骨分化经茜素红染色法鉴定，成软骨分化经阿尔辛蓝染色法鉴定。

 成脂、成骨、成软骨诱导分化操作步骤

一、成脂诱导分化步骤

1.将间充质干细胞置于37℃，5% CO2的培养箱中培养。

2.当细胞生长到达对数期时，用0.05%Trypsin-0.02%EDTA进行消化。

3.将消化下来的间质干细胞按照2x104 cells/cm2的细胞密度接种在六孔板中，每孔加入2mL完全培养基。

4.将细胞置于37℃，5%CO2的培养箱中进行培养。

5.每隔三天换液，直到细胞融合度达到100%或者过融合。

6.小心地将间质干细胞完全培养基吸走，向六孔板中加入2mL间充质干细胞成脂诱导分化培养基A液。

7.诱导3天后，吸走六孔板中的A液，加入2mL间充质干细胞成脂诱导分化培养基B液。8.24h后，吸走B液，换回A液进行诱导。

9.A液和B液交替作用3-5次后(12-20天)，继续用B液维持培养4-7天直到脂滴变得足够大、圆。B 液维持培养期间，每隔2-3天需要换用新鲜的B液。

成脂(油红O染色)成骨(茜素红染色)

二、成骨诱导分化步骤

1.将间充质干细胞置于37°℃，5% CO2的培养箱中培养。

2.当细胞融合度达到80-90%时，用0.05%Trypsin进行消化。

3.将消化下来的间充质干细胞按照2x104 cells/cm2的细胞密度接种在事先包被0.1%明胶的六孔板中，每孔加入2mL完全培养基。。

4.将细胞置于37℃，5%CO2的培养箱中进行培养。

5.当细胞融合度达到60%-70%时，小心的将孔内完全培养基吸走，向六孔板中加入2mL间

充质干细胞成骨诱导分化完全培养基。

6.每隔3天换用新鲜的间充质干细胞成骨诱导分化完全培养基(使用前需预热至37℃)

7.诱导2-4周后，视细胞的形态变化及生长情况，用茜素红进行染色。

注意:为防止成骨细胞脱落，建议成骨过程中出现大量钙结节之后，换液形式变为每两天一

次半量换液。

三、成软骨诱导分化步骤

1.进行成软骨诱导实验之前，需要对常规消化后的细胞进行计数。

2.将3-4x105个细胞转移到15mL离心管中，250 g离心4 min。

3.吸去上清，加入0.5mL预混液，重悬上一步离心所得沉淀，以清洗间充质干细胞，室温下150 g离心5 min。

4.重复步骤3，再次清洗细胞。

5.将上一步所得沉淀用0.5mL间充质干细胞成软骨诱导完全培养基重悬。

6.室温下150 g离心5 min。

7.拧松离心管盖以便于气体交换，将其放置于37℃，5% CO2的培养箱中培养。

注意:

①此步骤不要吸掉上清和重悬细胞。

②24小时之内不要摇动离心管。

8.当细胞团出现聚拢现象时(一般为24 h或48 h后，实际视细胞生长情况而定)轻弹离心

管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中。

9.自接种开始计算，每隔2-3d给细胞换用新鲜的成软骨诱导完全培养基，每管约0.5mL成

软骨诱导分化完全培养基。

注意:小心操作，不要吸出软骨球。

10.换液之后，轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中。稍加拧松离心管盖放入37℃，5% CO2的培养箱中继续诱导培养。

11.一般持续诱导21-28天后，可对软骨球进行福尔马林固定和石蜡包埋切片，最后进行阿利辛蓝染色。

成软骨(阿利新蓝染色)