使用酶标仪测定RNA浓度和纯度，这些要点要知道

1、全波段酶标仪开机预热20min；

2、设定紫外波长 260nm，向96孔板中加入 50ul ddH2O，放入样品室的池架上，校零；

3、将待测样品稀释（RNA 5ul用ddH2O稀释至50μl）混匀后，记录编号和稀释倍数；

4、把混匀的待测样品移入干净的比色皿中，放进样品室的架上，记录稳定的OD260(A260)的值；

5、以同样的方式测待测样品在280nm下的OD值；

6、计算待测样品的浓度与纯度:

RNA样品的浓度（ng/μl）=OD260×稀释倍数×40;

纯度=OD260/OD280

举例说明

某客户某一组样品RNA测得OD260=1.016Abs，OD280=0.533Abs

根据计算公式可得：

RNA浓度  1.016×40×10=406.4 ng/ul     

RNA纯度  1.016/0.533=1.906

此浓度和纯度均适合做PCR。

问题分析

1)蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。

2)苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。

3)多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。

4)设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1-0.5之间，此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10 mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。