细胞凋亡检测实验之《TUNEL染色》

细胞凋亡检测实验之《TUNEL染色》

细胞凋亡检测实验

荧光探针双标记法、形态学检测法、DNAladder法、Annexin V/PI双染色法、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin法)、TUNEL法、Caspase-3活性检测法。

TUNLE染色

TUNLE染色即原位末端转移酶标记技术。凋亡细胞的DNA双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3’-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)作用下，将脱氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物标记到DNA的3'末端，从而进行凋亡细胞的检测。TUNLE染色是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征。

实验步骤

使细胞或组织贴在载玻片上→固定→洗涤→通透→洗涤→预平衡→用荧光素12-dUTP标记断裂的DNA链→终止反应→洗涤→封片→分析样品

关键实验步骤

1.充分脱蜡和水化

脱蜡可以先 60°℃ 20 min，再用使用二甲苯两次5-10 min;而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀;

2.把握好细胞通透的时间

一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10-30 min，几μm 切片用短时间;几十um 切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。

3.适当延长 TUNEL 反应液的时间

一般是37°℃1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h，但要结合你最终的背景着色。

4.DAB显色条件的选择

一般 DAB 反应10 min左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30 min;promega公司提供的 DAB 液(桃红色)，不利于辨认棕褐色，我不太喜欢。

5.PBS的充分清洗

在 TUNEL 反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。

6.内源性POD的封闭也十分关键

对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。

注意事项

1.一定要设立阳性和阴性细胞对照。

2.阳性对照的切片可使用DNasel部分降解的标本，阳性细胞对照可使用地塞米松(1μM) 处理3-

4 h的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞。

3.阴性对照不加TdT酶，其余步骤与实验组相同。

4.复染的目的是为了衬托组织形态结构，以利于结果分析，石蜡切片常用苏木素，核染成兰色，冷冻切片常用甲基绿，核染成绿色。

5.PBS 用蒸馏水、Na2HPO4、KH2PO4配制，现在有卖的，自己加蒸馏水稀释后即可用，很方便，也不贵。

6.蛋白酶 K 消化蛋白后，需要用封闭液。

7.TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。

8.如果20xDAB 溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。