外泌体标记

                                                                                                                              外泌体标记

外泌体(Exosomes)是细胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)的一种，大小在30-150nm，由细胞内的多泡小体(Multivesicular bodies,MVB)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等。

为什么研究外泌体?

外泌体广泛参与细胞间物质运输与信息传递，调控细胞生理活动。同时，外泌体具有抗原提呈、免疫逃逸、诱导正常细胞转化、促进肿瘤发生和转移等作用;此外，外泌体还可以作为“天然的纳米粒子”来进行药物递送。

外泌体样本预处理与分离、保存:

外泌体存在于人类或动物的各种体液中，我们可以选择不同的样本来源进行相关的外泌体研究。由于外泌体是来源于细胞质膜内陷的含有脂质双分子层膜结构的多泡小体，分布于胞外基质。为了获得高纯度的外泌体，必须确保有效去除所有的细胞碎片及其他不需要的杂质。不同的实验样本采集时需要注意的地方不一样，如细胞培养上清在收集样本前需换成无外泌体血清培养、血浆样本采集时用一定不能用肝素抗凝管、尿液收集时需要加抑菌剂等。从生物体液中分离外泌体的各种方法已经被开发出来，主要根据外泌体的大小、密度、免疫特性等特点进行操作。分离出高纯度的外泌体是我们后续开展外泌体研究的关键步骤，目前差速超速离心是外泌体分离方法中公认的“金标准”。

外泌体鉴定:

外泌体分离之后，需要经过一系列鉴定才能确定分离的是外泌体。鉴定方法从物理特征到表面分子标志物，多角度进行鉴定。

(1)透射电镜鉴定法:简称TEM，适合外泌体双层囊膜超微结构观察，即通常为茶托型或一侧凹陷的半球形。

(2)纳米颗粒跟踪分析法:简称NTA，该方法能保证外泌体原始状态、检测速度快，检测后能提供外泌体粒径和浓度信息。

(3)western blot (western blot)分子标志物检测:外泌体标志蛋白包括四跨膜蛋白家族，如CD9、CD63和CD81;细胞质蛋白，如肌动蛋白(Actin)和钙磷脂结合蛋白(附件蛋白(Annexins);参与生物功能的分子，如凋亡转接基因2互作蛋白X(ALIX)、肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)、热休克蛋白 (HSP 70、HSP90)，以及细胞分泌的特异性蛋白。

外泌体高通量检测

外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质和核酸，可以运输蛋白质、mRNA、miRNA干扰RNA、环RNA等进入受体细胞，参与细胞间通讯。不同细胞来源的外泌体所含有的蛋白成分和核糖核酸不太相同，可作为多种疾病的早期诊断标记物，也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗。

1.MiRNA高通量测序

2.表达谱芯片(人、小鼠)

3.基因芯片(人、小鼠)

4.ceRNA芯片(人、小鼠)

5.蛋白质组分析(iTRAQ、TMT、Label-free)

外泌体示踪

对分离的外泌体进行体外标记或活体示踪，有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。目前常用亲脂性染料对外泌体进行标记，亲脂性染料主要包括两类，一是PKH67(绿色)和外泌体示踪和PKH26，二是Dil(橙色荧光)、DiO(绿色荧光)、DiD(红色荧光)、DiR(深红色荧光)。